美國(guó)藥典USP通則<1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry（質(zhì)譜法測(cè)定生物藥中殘留宿主細(xì)胞蛋白）主要介紹了LC-MS技術(shù)在宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)中的應(yīng)用，從樣品制備、質(zhì)譜測(cè)試條件的建立、數(shù)據(jù)的分析、質(zhì)譜方法驗(yàn)證等多個(gè)方面，詳細(xì)闡述了質(zhì)譜技術(shù)在HCPs中應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)與注意事項(xiàng)。作為一種先進(jìn)的分析技術(shù)平臺(tái)，質(zhì)譜技術(shù)在HCPs分析中的應(yīng)用，以及與ELISA方法和其他分析方法結(jié)合使用，有助于生產(chǎn)企業(yè)在產(chǎn)品的整個(gè)生命周期中更好地理解和建立HCPs的檢測(cè)方法，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。

各國(guó)法規(guī)要求必須對(duì)生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平；即使終產(chǎn)品中痕量的宿主細(xì)胞蛋白HCP到達(dá)患者體內(nèi)，尚不清楚特定的殘留蛋白質(zhì)雜質(zhì)是否會(huì)影響藥物的穩(wěn)定性或免疫原性。關(guān)于HCP的限量標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)藥典推薦值為終產(chǎn)品的HCP水平1-100 ng/mg；中國(guó)藥典各論中E.coli菌體HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.10% (1000 ng/mg)，CHO細(xì)胞HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.05% (500 ng/mg)，假單胞菌HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.02% (200 ng/mg)。

對(duì)于HCP抗體的純化方法，目前美國(guó)藥典1132章節(jié)推薦有兩種方式，包括protein A或protein G親和柱層析法和HCP抗原親和柱層析法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，均符合監(jiān)管的要求。在實(shí)際使用過(guò)程中，這對(duì)不同產(chǎn)品可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異。兩者方法得到的抗體主要區(qū)別是HCP抗體有效含量的占比。HCP抗原親和柱層析法顯然占比高，但是也存在某些HCP抗體丟失的情況，這也會(huì)導(dǎo)致針對(duì)某些樣本的檢測(cè)結(jié)果比前者偏低，需要企業(yè)在實(shí)際方法建立時(shí)進(jìn)行充分的評(píng)估。HCP抗原親和柱層析法對(duì)純化工藝要求更高，為保證抗體批間一致性，需要重點(diǎn)考察HCP抗原柱制備工藝、柱子的使用壽命、再制備的一致性等問(wèn)題。

為什么定制化試劑盒是宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇？原因之一是來(lái)源特定工藝下抗原及校準(zhǔn)品更具代表性。不同生物制品的上游生產(chǎn)工藝，包括培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件，收獲時(shí)機(jī)等差異，均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的HCPs的蛋白種類、豐度以及蛋白翻譯修飾不同，因此進(jìn)入到下游純化工藝的HCP類型也隨之發(fā)生變化，尤其是與藥物主成分共純化的HCPs會(huì)成為優(yōu)勢(shì)蛋白而存在于藥物原液或制劑中。HCP定制化ELISA檢測(cè)試劑盒通常選取實(shí)際生產(chǎn)工藝中上游發(fā)酵后的樣品進(jìn)行抗原及校準(zhǔn)品的制備，所制備的校準(zhǔn)品可以較為充分地反映實(shí)際生產(chǎn)工藝中的HCP，減少因抗原校準(zhǔn)品種類不足導(dǎo)致的漏檢以及定量不準(zhǔn)確的風(fēng)險(xiǎn)。

按照美國(guó)藥典1132章節(jié)的要求，HCPs校準(zhǔn)品需滿足代表性要求，即能覆蓋實(shí)際工藝產(chǎn)品生產(chǎn)中的HCPs。從HCP免疫檢測(cè)方法使用目的和預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)管理要求考慮，滿足工藝開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，同時(shí)為了應(yīng)對(duì)下游工藝中潛在的異常工藝失效，或工藝變更需求，建議采用上游發(fā)酵工藝末端，如澄清處理后工藝點(diǎn)的樣本作為HCPs的來(lái)源。在實(shí)際制備中，可采用空細(xì)胞或空載細(xì)胞在模擬實(shí)際工藝的預(yù)定條件進(jìn)行采集，通過(guò)二維電泳或高分辨率質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行模擬工藝和實(shí)際工藝下HCPs的代表性表征分析。越靠近下游HCPs蛋白種類越少，也越接近DS中HCPs，但是其可能無(wú)法滿足工藝開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證需求，也無(wú)法保證工藝的潛在風(fēng)險(xiǎn)，往往不推薦使用，或只作為上游工藝HCPs免疫檢測(cè)法的輔助使用。

湖州申科生物結(jié)合不同宿主實(shí)際的生產(chǎn)工藝，通過(guò)高質(zhì)量免疫原和 HCP 多抗的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，獲得高效價(jià)、高覆蓋率的抗體，開(kāi)發(fā)了適用于大腸桿菌表達(dá)菌 (BL21) 生產(chǎn)工藝、克隆菌堿裂法提取質(zhì)粒工藝的 SHENTEK®E.coli HCP檢測(cè)試劑盒， 適用于CHO\MDCK\HEK293\Sf9\VERO\畢赤酵母等不同宿主的 HCP 檢測(cè)試劑盒。用于中間品、原液及終產(chǎn)品等的HCP定量監(jiān)測(cè)。為確保 ELISA 對(duì)HCP定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，須對(duì) HCP 抗體覆蓋率進(jìn)行驗(yàn)證。湖州申科抗體覆蓋率平臺(tái)采用2D Clean-up 試劑盒去除蛋白樣品的干擾物（洗滌劑、鹽、脂質(zhì)、酚類和核酸等離子污染物），并設(shè)置2D 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，同時(shí)以陰性抗體為對(duì)照平行試驗(yàn)，以提高結(jié)果準(zhǔn)確度。