細胞轉染常用步驟：1.轉染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。5.加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。6.到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養基繼續培養24－48小時使用基質珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。徐州正規細胞高效轉染試劑廠家推薦

細胞轉染效率低下的幾個大坑：1.準備不足做脂質體轉染的時候，在開展正式實驗前要多做預試驗，優化轉染條件。優化轉染條件包括：脂質體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間等等。2.電壓過大做電轉的時候，如果電壓太大，往往會發生細胞大量死亡的情況。不同的細胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗，多摸索條件。對于大多數細胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進行轉染的細胞應該處于對數生長期。處于對數生長期的細胞的抗損傷能力是較強的。細胞濃度應該處于5x106到1x107／mL之間。每次轉染的質粒應該控制在4-6μg，如果﹥10μg，轉染效率也較大降低。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細胞恢復損傷。濟南細胞高效轉染試劑哪家好瞬時轉染后，可在48h-72h細胞長滿之后，提取細胞蛋白或者RNA。

細胞轉染為什么不能加血清：傳統的轉染試劑一般會增加細胞的通透性，這樣會把血清中的成分帶入細胞，造成細胞毒性。陽離子脂質體，轉染的過程是帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。血清中含有大量的蛋白質，在轉染過程中，帶負電的蛋白質可能干擾陽離子脂質體對核酸的吸附，影響轉染效率。同時，也會將血清中的蛋白帶入細胞，引發細胞毒性，故不能有血清轉染。這些轉染試劑要求在轉染前換無血清培養基，轉染后4-6h在更換成有血清培養基，這其實是為了減輕轉染造成的細胞毒性和轉染效率的降低。

細胞轉染的注意事項：細胞狀態這點非常重要，不要急于求成，一定要讓細胞處于較佳的生長狀態再做。有文獻說傳代不要超過17代。細胞復蘇后的3代左右時細胞狀態較好，不要用傳了很多代的細胞去做，細胞的形態都會發生變化。大多數已建立的細胞系都是非整倍體，原代培養包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變，總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發現這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。因此，如果觀察到轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復較佳結果。或者，幾種來源于經篩選，轉染效率較高細胞亞系的細胞系現在有售脂質體可以和帶負電荷的核酸結合后重新形成復合物。

細胞轉染實驗簡介：實驗材料與器材：1、材料293T細胞、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑(TransFast)2、器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計數板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺式離心機、35mm培養皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD。利用脂質體轉染法較重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。代細胞和傳代次數多的細胞都不是較佳選擇。金華細胞高效轉染試劑廠家現貨

瞬時轉染的細胞中，外源基因得以表達但它們并不會整合到細胞的基因組中。徐州正規細胞高效轉染試劑廠家推薦

穩定轉染細胞系的篩選：生長的細胞比不分裂的細胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉染后，在開始篩選前等待48-72小時，使細胞表達足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時可以自我保護。轉染后48-72小時倒掉培養基，加入含有GENETICIN物品的培養基，物品的濃度根據劑量反應曲線確定，足夠殺死未轉染細胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度，包括細胞類型，培養基和血清濃度等，所以有必要對每種細胞作一個劑量反應曲線，確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時間，因為在致死劑量的GENETICIN物品存在條件下，細胞會分裂1-2次。在次培養細胞時使用較低劑量的物品，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細胞一般是離散的克隆，根據實驗目的不同，可以分別純化（克隆），收集進行大量培養或染色并進行抗性克隆的計數。徐州正規細胞高效轉染試劑廠家推薦

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