原代細胞與細胞系：原代細胞來源于或是新近死亡的供體，通過機械或酶方法解離獲得，其方案根據來源物種（例如人，小鼠）和所涉及的組織類型而變化。通常包含以下步驟：組織切割和切碎，酶解，反復洗滌，研磨和微濾分餾，較后重新懸浮和接種收集的細胞群。對于松散的、被纖維結締包圍的組織，機械均質化可能足以進行解離。如果您的組織來源是外周血，差速離心便可以分離目的細胞。由于與細胞分裂相關的染色體端粒縮短，原代細胞在體外的壽命有限。大約20到60次分裂后，端粒變得太短而無法承受另一個循環，導致細胞分裂停止。這種現象被稱為Hayflick極限。對于具有無限倍增能力的細胞系，必須通過細菌或化學誘導方法的轉化使其永生化。細菌對于細胞的基因編輯引入有效促進增殖的基因（例如SV-40，E6，E7），允許細胞無限的細胞分裂1。同樣地，化學誘導方法（例如電離輻射，氯化鎳，苯并芘）改變原代細胞的基因組成，也可實現無限增殖。從而獲得與體內生理功能更接近的數據。南京正規原代細胞分離試劑盒直銷廠家

使用RFect系列小核酸轉染試劑做siRNA/miRNA轉染測實驗注意事項：1.細胞接種：一般做轉染前現在接種/鋪板（細胞計數大約5*10^4cell/ml），使做轉染前細胞密度在30-50%；如果細胞是原代細胞，接種密度可以密一些，細胞計數在2*10^6cell/ml；懸浮細胞可以在轉染當天接種/鋪板（細胞計數大約5*10^4cell/ml），待細胞狀態穩定后做轉染前細胞密度30-40%。2.為了能在使用時有較好的轉染效果，靠前次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉染試劑即可。將較佳轉染條件（siRNA與轉染試劑的用量、比例）放大到對應的孔板即可~鄭州正規原代細胞分離試劑盒很適合用于藥物測試、細胞分化和轉化等實驗研究。

原代細胞培養實驗室常規步驟為：1）將動物組織從機體中取出并消毒除去存留在組織上的細菌、細菌、等污染源，這些污染源將會所需培養的原代細胞凋亡、停止生長和繁殖直至死亡，因此整個原代細胞培養過程中較全在無菌狀態下進行。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘，通常在37C水浴里進行，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細胞的類型，比如成骨、肌肉、心、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個細胞，但是對于腦組織和乳腺等軟組織，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶，以免損傷分散出來的單個細胞。

原代細胞的小知識：凍存通常我們不推薦重新凍存原代細胞，因為這可以促進細胞衰老和/或導致功能變化。原代細胞非常敏感，重新凍結可能導致細胞死亡或損傷。與細胞系不同，原代細胞增殖有限，我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移，如果你正在使用一個增殖困難的細胞類型，你應該密切監測細胞形態，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移，大量生長從而成為主要細胞。正常的原代細胞培養，在無污染的情況下，建議培養基中不加抗體，抗體會影響細胞的某些基因變異從而導致實驗數據有差異，所以cellsystems的細胞在分離提取時就考慮到這點，他們不會采用任何抗體去分離和純化的同時，通過酶消化或者離心洗滌的方法讓細胞達到95%以上的純度，這樣得到的實驗數據更為準確。如果接種的細胞密度過低，細胞之間的促生長作用很小。

原代細胞應用困局：經過一次傳代后，原代細胞培養物就會成為二級細胞培養物，也稱為細胞株。然而，盡管稱為細胞株，但其壽命是有限的（除非如前所述永生化）。這種有限的分裂能力體內的細胞相似，一旦細胞在體內完全分化以發揮其特殊功能，細胞將停止增殖-這是固有的保護性衰老過程。此外，某些原代細胞有絲分裂后，無論是在體內或體外培養中都不增殖（例如，神經元，骨骼肌細胞，心肌細胞，周細胞，終末分化的肝細胞）。因此，每次進行實驗后，原代細胞培養都需要再次從新鮮的組織中解離。盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養能否成功的關鍵。南京正規原代細胞分離試劑盒直銷廠家

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原代細胞培養注意事項：1.收到細胞時，要鏡下觀察是否有污染情況；收到細胞的前幾天，要做好各種倍數的鏡下拍照記錄，以防細胞出現問題后，可以跟公司很好地溝通。2.收到細胞后，不要馬上處理。應置于培養箱中靜置4h以上再操作。如果不著急，可靜置過夜。3.細胞的靠前次傳代，一定要密度高一些傳代，原代細胞傳代密度低，很難長起來。建議1:2-1:3傳代。4.原代細胞傳代時（內皮細胞，貼壁為例），0.25%+0.53nM的胰酶消化，1ml消化液37度培養箱內消化30sec，再加入5ml培養基（正常消化貼壁細胞，我們使用胰酶和培養基的量是1:1，但是原代細胞必須用大量培養基中和胰酶）。5.原代細胞不建議凍存，因為凍存很容易復活不成功。如果要凍存的話，建議在P2或P3代凍存，凍存液中的血清越多越好，建議比例9（血清）:1（DMSO）。6.原代細胞復蘇時，置于37-38度水浴融化細胞，并加入10ml培養液（正常貼壁細胞復蘇時，也可以使用這種比例，復蘇成活率會較大提高），離心重懸鋪板南京正規原代細胞分離試劑盒直銷廠家