轉染的注意事項:用于蛋白生產的細胞的轉染可以在添加有血清或無血清培養基中進行。但更傾向于使用無血清培養基表達蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養基一般針對某一特定細胞類型優化并有幾類無血清培養基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養基低得多)。無蛋白培養基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學成分的培養基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應用的一種。在含血清時轉染的細胞可以適應無血清培養基,無蛋白培養基或限定化學成分的培養基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應無血清或無蛋白培養基的細胞,可以使用其培養基進行轉染。其他一些無血清培養基包含克制陰離子脂質體介導轉染的成分,在這些情況下,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養基中進行培養和轉染選擇傳代次數較低并處于對數生長期的細胞進行轉染。溫州細胞高效轉染試劑廠家現貨
細胞轉染常用步驟:1.轉染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉染試劑,再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養板中的培養基,用PBS或者無血清培養基清洗一次。5.加入混合液,將細胞放回培養箱中培養一個小時。6.到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液,之后加入完全培養基繼續培養24-48小時~正規細胞高效轉染試劑哪里買建議選擇50%~80%區間密度進行細胞轉染。
轉染的注意事項:細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。一般轉染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2×106-4×106細胞/ml時效果較好。確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。在三種不同密度進行細胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應增加了。這些結果說明,對于轉染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質體試劑的量會因細胞密度而異。
細胞轉染實驗簡介實驗步驟:1、細胞傳代(1)試驗準備:200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管架,微量移液器,記號筆,培養皿,離心管。(2)棄掉培養皿中的培養基,用1ml的PBS溶液洗滌兩次。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液,消化1分鐘(37。C,5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁,觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。(5)用頭多次吹吸,使細胞完全分散開。(6)將培養液裝入離心管中,1000rpm離心5min。(7)用培養液重懸細胞,細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。(8)將合適體積完全培養液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養皿中,使其均勻分布。(9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養,第二天轉染。蛋白表達和培養基的選擇哺乳動物細胞系合成可溶的。
細胞轉染簡介:轉染,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。對大多數細胞而言,均需要在轉染當天或前現在鋪板,第二天上午進行轉染。開封正規細胞高效轉染試劑哪家便宜
有血清時的轉染 血清一度曾被認為會降低轉染效率。溫州細胞高效轉染試劑廠家現貨
細胞轉染效率低下的幾個大坑:1.準備不足做脂質體轉染的時候,在開展正式實驗前要多做預試驗,優化轉染條件。優化轉染條件包括:脂質體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間等等。2.電壓過大做電轉的時候,如果電壓太大,往往會發生細胞大量死亡的情況。不同的細胞,需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗,多摸索條件。對于大多數細胞來說,其較佳電壓位于250-1250v/cm。另外,就是進行轉染的細胞應該處于對數生長期。處于對數生長期的細胞的抗損傷能力是較強的。細胞濃度應該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉染的質粒應該控制在4-6μg,如果﹥10μg,轉染效率也較大降低。電擊后,應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘,使細胞恢復損傷。溫州細胞高效轉染試劑廠家現貨
如何有效提高細胞轉染實驗效率:1.選擇高效的轉染方法不同轉染試劑有不同的轉染方法,但大多大同小異。轉染時應跟據具體轉染試劑推薦的方法,但也要注意,因不同實驗室培養的細胞性質不同,質粒定量差異,操作手法上的差異等,其轉染效果可能不同,應根據實驗室的具體條件來確定較佳轉染條件。2.確保所構建載體的質量。轉染載體的構建(細菌載體,質粒DNA,RNA,PCR產物,寡核苷酸等)也影響轉染結果。細菌載體對特定宿主細胞傳染效率較高,但不同細菌載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細胞周期,如逆轉錄細菌需侵染分裂期的宿主細胞,此外還需考慮一些安全問題(如基因污染)。除載體構建外,載體的形態及大小對轉染效率也有不...